新芋螺毒素基因的克隆及其遗传进化分析

摘要：全世界有约800种芋螺，每种芋螺产生多达2000种的肽类毒素，这些毒素可以作用于电压门控离子通道（Na+，K+，Ca2+）、配体门控离子通道（nAChRs. 5-HT3R，NMDAR）、G蛋白偶联受体（神经降压素和血管加压素）和神经递质转运蛋白。虽然已有大量的芋螺毒素通过毒液分离、cDNA克隆和转录组测序获得，但已发现的芋螺毒素不足其总量的0.5%。A―超家族中。α-芋螺毒素基因结构包含了一个内含子和被该内含子分开的两个外显子，成熟肽具有标准的4个半胱氨酸骨架（CC-C-C）。本研究利用具有保守性的。α-芋螺毒素基因内含子序列，采用多个PCR退火温度，从海南产疣缟芋螺中克隆到了1个新的具有6个半胱氨酸骨架（CC-C-C-CC）的M-超家族芋螺毒素基因和1个含有5个半胱氨酸新颖骨架（CC-C-C-C）的未知新家族芋螺毒素，并对它们的基因结构、成熟肽序列，以及与其他M-超家族芋螺毒素的遗传进化关系进行了深入分析。首次证实保守的α-芋螺毒素基因内含子序列可能存在于其他超家族中。关键词：多退火温度：内含子；PCR；芋螺毒素基因：进化树中图分类号：Q781
文献标识码：A
文章编号：1007-7847（2015）02-0106-08Gene Cloning of Novel Conotoxins and Phylogenetic AnalysisMENG Hai-ling， LIU Qian， LIN Bo， ZHU Xiao-peng， WU Yong， LUO Su-lan， ZHANGSUN Dong-ting（Key Laboratory of Tropical Biological Resources， Ministry of Education； Key Lab for Marine Drug of Haikou， Hainan University，Haikou 570228， Hainan， China）Abstract： There are around 800 species of cone snails living in the world tropical ocean. Venom of each cone snail species consists of up to 2 000 conopeptides or conotoxins， which are targeting voltage-gated ion channels （Na+， K+， Ca2+）， ligand-gated ion channels （nAChRs， 5-HT3R， NMDAR）， G-protein―coupled receptors （neurotensin， vasopressin）， and neurotransmitter transporters （NET）. However， the number of conotoxins identified is less than 0.5% of the total conotoxins. The genomic a-conotoxin precursor genes of A-gene superfamily contain a long intron inserted in their pro-region and divided their encoding region into two exons. The aconotoxins consist of standard four-Cys framework （CC-C-C）. Here， the C.lividus genomic DNA was used as a template for gene cloning of novel non-a-conotoxins using the conserved intron of a-conotoxins by PCR at multiple annealing temperatures. Two novel conotoxin genes， Lv HI -M01&LvXX VD-M02， were cloned from genomic DNA of C. lividus native to Hainan， China， which do not belong to classic a-conotoxins. mi-M01 encodes a new member of M-superfamily with six-Cys framework （CC-C-C-CC）. And LvWW-M02 encodes a new conotoxin of unknown gene superfamily with five-Cys framework（CC-C-C-C）， which is a new cys pattern. Gene structure， sequence characteristics and phynolgeny of the two novel conotoxins were analyzed. It is the first time showing that the conserved intron sequence of a-conotoxins exists in other gene superfamily.Key words： multiple annealing temperature； intro； phynolgeny 1polymerase chain reaction （PCR）；conotoxin gene； （Life Science Research，2015，19（2）：106?113）
全世界有大约800种芋螺，一种芋螺可以产生多达2000种肽类毒素，用来捕获猎物、防御或者威慑竞争对手[1]。这些毒素可以作用于电压门控离子通道（Na+，K+，Ca2+）、配体门控离子通道（nAChRs，5-HT3R，NMDAR）、G蛋白偶联受体（神经降压素和血管加压素）和神经递质转运蛋白，因此成为药理学探针和药物开发研究的热点，用来治疗神经痛、帕金森综合症、老年痴呆症、多发性硬化症、精神分裂症、癫痫、中风、肌无力、癌症、艾滋病、关节炎等疾病[2]。 芋螺毒素肽人多数包含10～50个氨基酸和0-5个二硫键[3]，大致分为两种，一种是富含二硫键的芋螺毒素，即含有两个或两个以上二硫键；另一种是含有一个二硫键或者不含二硫键的芋螺肽。芋螺毒素前体蛋白包含三部分：位于N端保守的信号肽区，相对保守的前体肽区和位于C端极不保守的成熟肽区[4]。根据前体蛋白信号肽的序列相似性，至今可分为A-，B1-，B2-，B3-，C-，D-，E-，F-，G-，H-…等26个超家族；根据芋螺毒素成熟肽区半胱氨酸骨架及二硫键位置的不同，可分为26类（I，II，III…XXVI）；据其药理活行靶位又可分为α-，γ-，ζ-，δ-，ι-，κ-，μ-，ρ-，σ-，χ-，ω-11个家族[4-6]。α-芋螺毒素是指特异性结合乙酰胆碱受体的芋螺毒素，其半胱氨酸骨架为I类CC-C-C，依据Cys2与Cys3，Cys3与Cys4之间氨基酸的数量，α-芋螺毒素被分为α（3，5）、α（3.6）、α（4，3）、α（4.5）、α（4，4）、α（4，6）、α（4，7）、α（4，8）、α（5.10）9种亚家族。目前已有大量的芋螺毒素通过毒液分离、cDNA克隆和转录组测序获得[7-12]，但已发现的芋螺毒素不足其总量的0.5%。因此，不断发现更多新芋螺毒素显得尤为重要。以往研究表明，11-、12-、M-、02-、03、P、S、T-超家族基因结构为两个内含子隔开3个外显子，而α-芋螺毒素基因只含有―个内含子，它在前体肽区隔开两个外显子，使得第2个外显户包含部分前体肽区和完整的成熟肽区[13]，且其内含子3'末端有一定的保守性[14]。本实验依据其保守的内含子3'末端与3'非翻译区设汁引物，以海南产疣缟芋螺基因组DNA为模板，采用多个退火温度克隆芋螺毒素新基因，期望发现更多新的芋螺毒素，用于后续的结构与功能的深入研究。1 材料与方法1.1 材料与试剂供试材料疣缟芋螺（Conus lividus）活体，从海南岛、西沙群岛采集，-80℃保存；海洋动物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）；琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公刮）；pMDTM19-T Vector Cloning Kit（宝生物工程（大连）有限公司）；质粒小提试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）；其他化学试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物由上海生工合成，试剂配制：氨苄100mg/mL，IPTG24 mg/mL，X-Gal20mg/ml。1.2毒腺基因组DNA的提取-80℃活体直接冻存的疣缟芋螺，解冻后取毒腺组织约10mg，用海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA。1.3DNA克隆与测序提取的疣缟芋螺基因组DNA约0.1μg用作PCR模板，据内含子3'末端保守序列及3'端非翻译区基因序列设计引物，内含子上游引物A1：GTGGTTCTGGGTCCAGCA；下游引物A2：GTC-GTGGTTCAGACCCTC。PCR程序为94℃10min预热，94℃ 30 s，Tm 30 s，72℃ 30s 30个循环，最后72℃延伸10min。Tm设置为46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃共11个退火温度分别进行PCR。将每个温度的PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因，然后与pMDTM19-T载体4℃连接过夜，转化到DH5α感受态细胞，在含有40μL，X-gal和10μL IPTC的氨苄琼脂LB培养基上挑选白色菌落，每个培养基挑选20个菌落，用M13引物进行PCR检测重组子，阳性克降送上海生工进行测序。1.4新芋螺毒素基因序列及其遗传进化分析测序结果用在线下具包VecScreen和DNAstar软件进行分析，得到芋螺毒素基因和前体肽序列，再经NCBI上的BIASTN和ConoServer上的exact match系统比对，以及与芋螺毒素专利和其他相关文献中的序列比较，发现了1个新的M超家族芋螺毒素基因序列和1个新的未知超家族的含有5个半胱氨酸的芋螺毒素基因序列。并且基于ConoServer数据库，对相似的155个M超家族Ⅲ类芋螺毒素成熟肽区的蛋白序列，采用Clusta1X2软件[15]多重序列比对后，导人MEGA6.0[16]软件，用邻近法（neighbor-joining method）[17]，JonesTraylor Thornton（JTT）[18]模式和成对删除空白（pair-wisedeletion of gap ）[19]构建进化树。2结果与分析2.1两个新芋螺毒素基因的克隆根据a-家族芋螺毒素保守内含子序列设计引物，以疣缟芋螺基因组DNA为模板，通过在46℃～56℃范围内改变退火温度，进行PCR扩增。从11个批次的PCR产物中，挑选了220个阳性克隆测序，通过序列比对，得到的结果中大多数是具有1类半胱氨酸模式（CC-C-C）的α-芋螺毒素。但除此之外，我们还从退火温度为48℃的PCR产物中筛选克隆到一条新的、具有III类半胱氨酸模式（CC-C-C-CC）的M-超家族芋螺毒素（图1A）。从退火温度为52℃的PCR产物中筛选克隆到一条具有新的半胱氨酸模式（CC-C-C-C）的、含有5个半胱氨酸的未知超家族芋螺毒素基因（图1B），我们将该5-Cys半胱氨酸模式定义为第27类，即XXⅦ。根据芋螺毒素系统命名法，将含有Ⅲ类半光氨酸骨架模式的新毒素命名为LvⅢ-M01，将含有5个半胱氨酸骨架的新毒素命名为LvXXⅦ-M02。成熟的芋螺毒素一般是从胰蛋白酶切割位点R处，经翻译后修饰，从前体肽中被释放出来、据此，这两个新芋螺毒素基因的成熟肽区，分别含有32个和22个氨基酸。以往用这种方法克隆的芋螺毒素基因都是属于A超家族中的α-芋螺毒素，而本实验首次用α-芋螺毒素基因的内含子克隆到了新的非α-芋螺毒素基因，证实了保守的α-芋螺毒素基因内含子序列不仅存在于A-超家族芋螺毒素基因中，也存在于其他超家族中，如M-或其他未知超家族基因中。2.2LvⅢ-M01的序列特征及其遗传进化分析2.2.1LvⅢ-M01的归类M-超家族芋螺毒素有8种不同的半胱氨酸骨架，但是绝大多数具有第Ⅲ类半胱氨酸模式（ CC-C-C-CC），且此模式仅存在于M超家族，目前，依据信号肽的不同，M-超家族被分为MLKM和MMSK两大类[20]，而依据Cys4与Cys5之间氨基酸数量的不同，M-超家族又被分为M-1，M-2，M-3，M-4和M-5 5个分支；此外，由于M-超家族毒素成熟肽氨基酸数目差异较大，将5个分支中成熟肽氨基酸数目小于22的毒素称为Min-M家族，大于22的称为Max-M家族[21、22]。在功能方面，M-超家族芋螺毒素不仅可以阻断钠离子通道（μ-家族），还可以阻断钾离子通道（K-家族）。目前，从疣缟芋螺中克隆到的M-超家族基因，仅有M-1，M-2，M-3 3个分支（表1），我们发现的LvII-I-MO1成熟肽区有32个氨基酸，而CyS4与Cys5之间有4个氨基酸，可以归为M-4分支的Max-A4家族（图2）。2.2. LvⅢ-M01的蛋白序列特征 本文以α-芋螺毒素基因内含子3'末端保守序列为PCR的上游引物，以α-芋螺毒素基因的3'非翻译区为下游引物，采用了11个PCR退火温度，克隆到这两个新基因。系列退火温度范围为46℃～56 0C，包括46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃， 53℃，54℃，55℃和56℃。研究发现，只有退火温度在48℃下的PCR产物条带稍大，而且转化后阳性克隆验证时，其条带明显比其他条带要大，测序结果发现克隆到的是属于M-超家族的新芋螺毒素LvⅢ-M01。可见α-芋螺毒素保守内含子可能也存在于其他超家族基因中，而低温度退火有利于长片段的克隆。本文得到的LvXXⅦ-M02是在退火温度52℃发现的，而且其与α-芋螺毒素Ca1.6h基因序列仅有一个碱基的差别，该差别使得LvXXⅦ-M02增加了一个半胱氨酸。从上述分析可以看出，是α-芋螺毒素Ca1.6b的Tyr密码子的点突变而产生的基因突变产物，发生在Cys残基上的突变，对毒素结构和功能的改变影响是深远的，与原祖先毒素肽大相径庭。我们经过多次PCR重复测序，LvⅢ-M01和LvXXⅦ-M02的基因序列都是一致的，排除了PCR扩增突变的可能性。此外，本实验所用疣缟芋螺来源于海南岛海域。来自不同海域的芋螺，即使是同种芋螺也可能由于环境不同而表达不同的毒素[28]，更甚取自相同海域的同种芋螺不同个体之间也存在较大的种内等位基因的差异[29，30]，这也是新芋螺毒素基因产生的重要来源之一。该研究利用具有保守性的α-芋螺毒素基因内含子序列，从海南产疣缟芋螺中克隆到了1个新的具有6个半胱氨酸骨架的M-超家族芋螺毒素LvⅢ-M01基因和1个含有5个半胱氨酸新颖骨架的未知新家族芋螺毒素LvXXⅦ-M02，并对它们的基因结构、成熟肽序列、以及LvⅢ-M01与其他M-超家族芋螺毒素的遗传进化关系进行了深入分析。
为了深入研究LvⅢ-M01的分类地位及其遗传进化关系，我们基于Conosever数据库构建了M-超家族芋螺毒素成熟肽区半胱氨酸环（CCX2-7CX2-9CX1-5CC）内的进化树，从而发现了3个Loop区氨基酸的保守性，并据此分为Ma、Mb、Mc3个进化枝支。之前的研究也有将O-超家族芋螺毒素分为01、02、03[9]，I-超家族分为I1、I2、I3[31]，但它们都是依据信号肽的保守性来进行分类的，与真正起活性的成熟肽序列之间没有太多的联系。本文依据成熟肽氨基酸保守性进行分类，这样更便于指导研究芋螺毒素的功能。μ-家族芋螺毒素主要是通过离子静电相互作用结合于钠离子通道（Nav），从而阻断离子电导[32，33]，例如PⅢA、TⅢA、GⅢA从属于Mb分支，主要阻断Nav1.4，其原因是这3种芋螺毒素在Loop3区都有一个精氨酸与Nav1.4的关键氨基酸I区Glu403和Ⅱ区Glu758相互作用[2.34-36]。本实验发现的LvⅢ-M01 Loop3区也有一个精氨酸Arg（R），由此可推断LvⅢ-M01有可能会阻断Nav1.4，起到镇痛的疗效，其确切的功能有待进一步研究。
最后，本研究利用α―芋螺毒素保守内含子序列设计引物，从海南产疣缟芋螺中克隆到新的两条非α-芋螺毒素基因，不仅首次证实了α-芋螺毒素保守内含子序列可能还存在于其他超家族基因中，如M-超家族的μ-家族，而且扩充了芋螺毒素基因库，丰富了芋螺毒素的多样性，为下一步的人工合成、结构与功能的研究奠定厂基础。参考文献（References）：[1]GERWIG G J， HOCKING H G， STOCKLIN R， et d. Glycosylation of conotoxins[J]. Marines Drugs， 2013， 11（3）： 623-642. [2]LEWIS R J， DUTERTRE S， VETTER I，et al. Conus venom peptide pharmacology [J]. Pharmacological Reviews，2012，64（2）：259-298.[3]TERLAU H， OLIVERA B M. Conus venoms： a rich source of novel ion channel-targeted peptides [J]. PhysioJ Reviews. 2004， 84（l）：41-68.[4]HILLYARD D K， OLIVERA B M， WOODWARD S， et al. A molluscivorous Conus toxin： conserved frameworks in conotoxins[J].Biochemistry，1989，28（1）：358-361.[5]KAAS Q， YU R， JIN A H， et al. ConoServer： updated content， knowledge， and discovery tools in the conopeptide database[J].Nucleic Acids Research，2012，40（Database issue）JD325-D330.[6]KAAS Q， WESTERMANN J C， CRAIK D J. Conopeptide characterization and classifications： an analysis using ConoSeiver[J]. 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