丹皮酚与钙粘素相互作用的分析研究_免费论文全文下载

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摘要丹皮酚对多种肿瘤细胞具有抑制作用，而钙粘素是与肿瘤产生和恶化密切相关的一类糖蛋白。本研究运用荧光光谱法和原子力显微技术探索了丹皮酚与钙粘素的相互作用。荧光光谱法研究结果表明，丹皮酚对钙粘素的荧光具有显著的猝灭作用，通过猝灭常数随温度变化趋势推断为静态猝灭过程。丹皮酚与钙粘素形成复合物的热力学参数分别为ΔH=

Symbolm@@ 4.3×105 J/mol和ΔS=-1.3×103 J/（mol・K）， 表明此�Y合过程以氢键和范德华力为主。原子力显微观察结果表明，钙粘素分子间可形成有序长链结构，丹皮酚加入后能显著破坏这种组装结构而形成短链结构，这是由于丹皮酚与钙粘素末端色氨酸残基的作用而影响相邻钙粘素分子结构域间的交错作用所致。本研究结果表明，钙粘素可能是丹皮酚体现其活性的一个重要作用靶点。
关键词丹皮酚； 钙粘素； 荧光光谱法； 原子力显微镜
1引 言
丹皮酚（Paeonol）是在传统中药牡丹皮中提取出的一种小分子酚类化合物。近来的研究发现丹皮酚具有抗肿瘤作用＼[1＼]。药理活性实验显示，丹皮酚对食道癌、胃癌、肝癌、结肠癌等多种癌细胞具有明显的抑制作用＼[2～4＼]。深入探索丹皮酚在体内的各种可能的作用靶点及它们之间的作用机制，可为进一步开发丹皮酚及其衍生物作为抗癌药物提供科学依据。
中药小分子可与人体内的蛋白发生相互作用，从而决定其药理活性作用＼[5＼]。研究发现，丹皮酚和阿魏酸在生理条件下均能与人血清白蛋白（HSA）发生相互作用，并且它们之间会竞争HSA上的同一位点。因此，中医用药常将含有丹皮酚与阿魏酸的中药配伍使用来提高疗效。丹皮酚在体内还可能与其它蛋白产生相互作用，进而影响其药理活性。
钙粘素（Cadherin）是在细胞与细胞粘附过程中发挥重要作用的一类钙离子依赖型粘附蛋白＼[6＼]。Pary ＼[7＼]和AnneKarina ＼[8＼]等的研究都证实了E钙粘素与癌症的发生和发展有重要联系。最近的研究表明，血清中E钙粘素的浓度增高与肿瘤发生及侵袭转移密切相关＼[9～12＼]。胃肠癌患者血清中可溶性钙粘素的浓度显著高于健康对照组，这可能是由于肿瘤细胞表面的E钙粘蛋白降解并释放到血液中的缘故。因而，血清中可溶性钙粘素的浓度可作为预防、诊断和治疗胃肠癌的一个重要指标＼[10，11＼]。
丹皮酚在血液中可与人血清白蛋白发生相互作用。最近的研究证实了丹皮酚可与人血清白蛋白以疏水作用形成复合物＼[13＼]。胃癌患者血清中可溶性钙粘素的浓度平均水平（9344 ng/mL）显著高于健康对照组（5616 ng/mL），并与肿瘤大小呈正相关＼[11＼]。因而，在胃癌患者的血清中，丹皮酚将有更多的机会与钙粘素发生相互作用。本研究采用荧光光谱法和原子力显微技术，分析了丹皮酚与钙粘素的相互作用过程。
2实验部分
2.1仪器与试剂
F7000荧光光谱仪（日本日立公司）； NanoPhotometer N60型超微量分光光度计（德国IMPLEN公司）； PicoplusⅡ型原子力显微镜系统（美国Molecular Imaging公司）。
丹皮酚（纯度≥99%， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 钙粘素（ECadherin human， recombinant纯度≥90%）和人血清白蛋白（HSA）， 购自于西格玛奥德里奇（上海）有限公司； 钙粘素原始浓度为0.5 mg/mL。 高定向热解石墨片（HOPG， 爱沙尼亚Mikro Masch公司）。实验用水由MilliQ系统（电阻率>18 MΩ cm）纯化制得。
2.2实验方法
2.2.1荧光光谱测定使用甲醇溶解丹皮酚，配制1 mmol/L溶液，然后用超纯水逐步稀释该溶液， 制得1 μmol/L丹皮酚溶液。用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.4）稀释钙粘素原始溶液，配制0.2 μmol/L钙粘素溶液，用于光谱测定。在室温和37℃条件下，依次向0.2 μmol/L钙粘素溶液中滴入不同体积1 μmol/L
丹皮酚溶液，混合液在恒温水浴保持5 min后，以280 nm为激发波长，在290～500 nm范围内记录荧光光谱图。
2.2.2原子力显微镜（AFM）观察样品的制备和表征采用磷酸盐缓冲液将不同温度条件下0.2 μmol/L钙粘素与1 μmol/L丹皮酚相互作用的溶液，稀释10倍，用于制作原子力显微镜观察样品。采用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH=7.4）稀释钙粘素原始溶液，配制0.02 μmol/L溶液，用于观察单独钙粘素结构。制作原子力显微镜观察样品时，分别取50 μL待观察溶液，滴加于新制备的高定向热解石墨片（HOPG）上，静置吸附10 min后，除去液滴，用超纯水冲洗10次以上，用以去除吸附不牢固的蛋白，最后用氩气吹干。在使用原子力显微镜观察前，将样品放在干燥器中保存。
在气相室温条件下，原子力显微镜采用轻敲模式进行成像。成像时使用NSC35探针（Mikromasch），针尖曲率半径

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