表面电荷对聚乙二醇修饰金纳米粒子生物行为的影响_免费论文全文下载

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摘要利用硫金键将末端修饰甲氧基、氨基或羧基的巯基化聚乙二醇（Thiolated polyethylene glycol，HSPEG）分子分别组装到金纳米粒子表面， 合成了3种带有不同表面电荷的聚乙二醇修饰金纳米粒子（PEGylated gold nanoparticles，PEGAu NP）。细胞共培养和小鼠尾静脉注射实验结果表明，表面电荷能够显著影响PEGAu NP的生物行为。细胞对PEGAu NP的吞噬量遵循正电荷

Symbol～@@ 电中性
Symbol～@@ 负电荷的规律。尾静脉注射的PEGAu NP能够随小鼠的血液循环由全器官分布逐渐向肝脾转移。表面带负电荷的PEGAu NP较难被小鼠肝脾清除，带但正电荷的PEGAu NP能够引起小鼠免疫系统较强的响应。
关键词聚乙二醇； 金纳米粒子； 活细胞； 活体分布； 生物相容性
1引 言
金纳米粒子（Gold nanoparticles，Au NPs）因具有光学性质可调、易通过SAu配位实现功能化等优点而被认为是构建诊疗一体化纳米探针及纳米药物的理想材料＼[1～6＼]。尽管基于Au NPs的纳米药物具有疗效高和副作用低的优点，但其生物安全性仍存在很多争议＼[7～9＼]。一些研究表明，Au NPs具有毒性效应，且与纳米粒子的大小、表面电荷及功能团高度相关＼[9～13＼]。如粒径（Dcore）10 nm的Au NPs细胞毒性则较弱，并随Dcore增大稍有增加。由于Dcore在10～100 nm 范围内的Au NPs能够自由进出细胞，并选择性进入特定细胞器，因此Au NPs有可能干扰细胞器的正常生理功能，具有潜在的细胞毒性＼[11～13＼]。Dcore相同的Au NPs，正电荷的Au NPs的细胞毒性高于电中性或负电荷的Au NPs。此外，通过配�w交换或进一步功能化，同样能够改变Au NPs的细胞毒性。Deol等＼[14＼]将树枝状分子接枝到谷胱甘肽修饰的Au NPs表面改善其细胞毒性。
随着Au NPs在生物医学和生物分析中的应用日益广泛，其相关毒理学数据不断丰富；但是大量、离散的实验设计， 导致相互矛盾的Au NPs毒性数据＼[7～13＼]。Goodman等＼[15＼]证明正电荷的2 nm Au NPs的细胞毒性大于电中性及负电荷的Au NPs。但Schaeublin等＼[16＼]发现无论是正电荷或负电荷的2 nm Au NPs均具有细胞毒性，并且负电荷的Au NPs的毒性更高。与大多数研究结果相反，Vetten等＼[17＼]发现20 nm Au NPs能够显著降低中国仓鼠卵巢细胞的活率。Yang等＼[18＼]认为不同Dcore 的Au NPs对小鼠均无生物毒性，然而Fraga等＼[19＼]发现20 nm Au NPs能够导致小鼠轻度贫血。另外，Au NPs的物理化学性质对其在活体器官中分布、迁移影响的研究相对较少＼[20，21＼]。为了充分揭示Au NPs的毒理学特征，需要系统评估Au NPs的理化性质与生物毒性的关系。本研究以生物相容性好的聚乙二醇（PEG）为基本配体单元，仅通过改变PEG末端的功能团获得3种带有不同表面电荷的PEG修饰的13 nm Au NPs， 系统考察了表面电荷对Au NPs与细胞相互作用及其在小鼠体内分布的影响。研究结果表明，表面电荷在细胞对Au NPs的吞噬和器官对Au NPs的富集过程中起重要作用。
2实验部分
2.1仪器、试剂与材料
UVmini1240紫外可见吸收光谱仪（日本岛津公司）； ELAN 9000/DRC电感耦合等离子体质谱（ICPMS，美国热电公司）； HITACHI H600型透射电子显微镜（TEM，日本Hitachi公司），5415R型高速离心机（德国Eppendorf公司）； NanoZS粒度仪（英国Malvern公司）； LEICA EM UC7型超薄切片机（德国LEICA公司）； Power Wave XS2 型微孔板分光光度计（美国BioTek仪器有限公司）。
氯金酸（HAuCl4・3H2O，美国SigmaAldrich公司）； 柠檬酸钠（Na3C6H5O7・2H2O，北京化工厂）； HSPEGNH2、HSPEGOCH3、HSPEGCOOH（其中PEG部分MW2000，美国Nanocs公司）； 3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲亚砜（DMSO）、青霉素和链霉素（上海鼎国生物技术有限公司）； DMEM培养基和胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）； HeLa（人宫颈癌细胞），THP1（人单核细胞），HepG2（人肝癌细胞），A549（人肺癌细胞）和293（人胚肾细胞）细胞株（中国科学院上海细胞库）； 其它试剂均为分析纯，购于北京国药集团； 实验用水为MilliQ（美国Millipore公司）制备的超纯水（18.2 MΩ・cm）。BalB/C小鼠（雌性，4～5周龄，约20 g体重，北京华阜康生物科技股份有限公司）。
2.2PEG修饰的金纳米粒子的合成与表征
参考TurkevichFrens＼[22，23＼]方法制备柠檬酸根保护的13 nm Au NPs。将3种PEG化合物按照Au NPs与PEG 摩尔比1∶5000分别加入10 mL Au NPs溶液中，室温下反应12 h后，将溶液离心（9000 r/min离心15 min）清洗3次，以除去未反应的PEG。将纯化后的PEG修饰Au NPs（PEGAu NP）分散于1 mL H2O中储存于4℃备用。根据PEGAu NP所带电荷的不同将其命名为G13X，其中G代表Au NPs，13代表Au NPs的粒径，字母X=C、N、A，分别代表带正电（Cationic）、中性（Neutral）和带负电（Anionic）的PEGAu NP。 2.3细胞毒性和吞噬实验
在37℃下，5% CO2培养箱中， 使用包含10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基以1 × 104 cell/mL 的密度将5种细胞（THP1、HeLa、MCF7、Hep G2和A549）接种于96孔板中。过夜孵育细胞后，更换含有不同浓度G13X（0，25，50和100 μg/mL）的新鲜培养基， 继续培养24 h。后去除含G13X的培养基，在200
SymbolmA@ L新鲜培养基中添加10 μL MTT （5 mg/mL）继续培养4 h，形成的甲瓒结晶用100 μL DMSO 溶解。用微型孔板分光光度计测量490 nm 处的吸光度值， 以未与G13X共培养的细胞为对照组， 相对细胞活率=（＼[A＼]test/＼[A＼]control）×100%。
为了检测细胞对不同G13X的吞噬量，将不同细胞种入6孔板，并用不含血清的培养基培养24 h。去除培养基后，将100
SymbolmA@ L含有100 μg/mL G13X的新鲜培养基分别加入到孔板内继续培养24 h。吸出培养基，并用100
SymbolmA@ L PBS清洗细胞3次，将细胞用胰蛋白酶消化并转移至离心管计数后离心（1000 r/min），得到细胞沉淀，冻干后用浓HNO3溶解，使用ICPMS测定金元素含量。
2.4金纳米粒子活体内分布和毒性实验
所有动物使用小鼠专用饲料和无菌水于清洁级环境（吉林大学实验动物中心）中饲养，动物实验均遵循吉林大学动物实验中心对动物实验的相关规定。
金纳米粒子活体体内分布：将实验用小鼠分为3组，对应3种Au NPs，每组9只小鼠。首先用10%（V/V）水合氯醛麻醉小鼠，尾静脉注射200 μL含有4 mg/kg G13X的生理盐水。在特定�r间点（注射后1、7和30天）选取3只小鼠，称重后处死，取出心、肝、脾、肺、肾、脑和骨髓等器官。称量器官重量后，用王水消化2 h得到液体，使用ICPMS测定器官中金元素的含量。使用未经Au NPs处理的3只小鼠作为对照组。
采用TEM观察肝、脾组织：通过尾静脉向小鼠体内注射200 μL含有4 mg/kg G13C的注射液。注射30天后将小鼠处死，快速取出肝和脾组织，经2.5%戊二醛前固定、1%锇酸后固定、乙醇系列脱水和Epon812环氧树脂包埋处理后，使用LEICA EM UC7型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片，然后用醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，用TEM观察及摄片。
Au NPs毒性实验：按上述相同方法处理小鼠，在注射G13X后1、7和30 天分别抽取血液用于血常规和ICPMS测试； 每个时间点将3只小鼠处死，取出心、肝、脾、肺、肾和脑等器官，使用10%（V/V）福尔马林中性缓冲液固定，取部分组织，用Hematoxylin&Eosin染色，在显微镜下观察并拍摄图片。以正常饲养的小鼠作为对照组。
3结果与讨论
3.1金纳米粒子合成与表征
Au NPs的UVvisible光谱和TEM表征如图1所示。所合成的柠檬酸根保护的Au NPs的平均粒径为（13.2±2.5） nm，最大表面等离子体共振（Surface plasmonic resonance， SPR）吸收峰为519 nm，与文献＼[22，23＼]报道的值一致。经PEG修饰后，G13X的UVvisible光谱没有发生显著变化，说明纳米粒子没有发生大规模的聚集。TEM表征也证明， G13X具有良好的分散性。表1给出了所合成的G13X在不同介质中的表面电荷（Zeta potential，ZP）和水合粒径（Hydrodynamic size，HD）。由于在G13X表面存在双电层，在纯水和磷酸盐缓冲溶液（PBS）中G13X的水合粒径比TEM所测得的粒径稍大。FBS中含有大量不同种类的蛋白质，能够通过自组装、静电吸附等相互作用在G13X表面形成一层蛋白质，因此在含有10%血清的PBS中， G13X的水合粒径远大于其在纯水和PBS中的水合粒径＼[24，25＼]。另外，带正电荷的G13X能够通过静电作用吸附大量带负电荷的蛋白质，其表面电势由正电荷转变为负电荷。
3.2Au NPs与细胞相互作用
选取5种来源于不同组织的细胞（THP1、HeLa、MCF7、Hep G2和A549），与G13X共培养，考察细胞种类和G13X表面电荷对G13X与细胞相互作用的影响。这5种细胞中， THP1具有免疫细胞的某些特征，Hep G2和A549具备代谢器官（肝、肺）细胞的主要特征，MCF7为腺细胞，HeLa和A549具有上皮细胞的特征。在100
SymbolmA@ g/mL G13X存在时，所考察的细胞均能保持
Symbol～@@ 95%的存活率，说明G13X具有较低的细胞毒性。如图2所示，当与100 μg/mL G13X共培养后，ICPMS分析结果表明，细胞对G13X的吞噬量与G13X的表面电荷以及细胞的种类有关。 5种细胞对G13X的吞噬量遵循G13C
Symbol～@@ G13N
Symbol～@@ G13A的规律， 不同细胞对同种G13X的吞噬量存在显著差异，即免疫细胞（THP1）对G13X的吞噬能力远大于体细胞，代谢能力强的细胞对G13X的吞噬能力也较强。这些实验结果与文献＼[12，13，26，27＼]的相关研究结果一致。细胞表面存在大量可与正电荷的G13C相互作用的电负性物质，这种静电吸引力能够增强G13C的跨膜能力，从而增大细胞对G13C的吞噬量。另外，在无FBS的培养基中，细胞处于饥饿状态，代谢能力强的细胞对细胞外物质的吞噬能力也较强。
3.3Au NPs的生物相容性 将G13X分别通过尾静脉注射到小鼠体内，在注射后第1、7和30天进行小鼠器官指数（器官重量除以小鼠体重）、血常规和免疫组化分析。如图3所示，在所考察的时间内，小鼠器官指数的变异系数（Coefficient of variation，CV）值小于8%，此结果表明，G13X对小鼠器官指数没有显著影响。与对照组相比，实验组小鼠的组织切片未表现出显著的毒性和副作用（图4）。血常规分析发现，实验组小鼠的白细胞（White blood cell，WBC）相对于对照组（正常饲养）小鼠的WBC均显著升高（表2）。在
注射G13X后第1天，小鼠的WBC升高了3倍以上； 在注射G13X后第1天，小鼠的WBC升高了3倍以上； 在注射G13X后第30天，小鼠的WBC仍是正常饲养的小鼠WBC的1.4倍以上。另外，注射G13C小鼠的WBC值大于注射G13N和G13A小鼠的WBC值。这些实验结果表明，尽管G13X未表现出明显的生物毒性，但能够引起小鼠免疫系统的强烈响应，并与G13X与细胞作用能力存在正相关性，即G13C
Symbol～@@ G13N
Symbol～@@ G13A。这种强烈的免疫响应有可能诱发某些重大疾病（如器官炎症等）。因此，在研发纳米药物时，必须考虑纳米材料对生命体系的长期影响。
3.4Au NPs在小鼠体内的分布
使用ICPMS对尾静脉注射G13X的小鼠体内主要器官（心、肝、脾、肺、肾、脑和骨髓）的金元素的含量进行了测定以获得G13X在各个器官的分布。在注射后1天，G13X广泛分布于小鼠的各个器官，其中肝和脾对G13X富集量较大（图5A）。在注射7天后，肝和脾中G13X的量显著增加并表现出表面电荷依赖性（富集量G13A>G13N>G13C），但其它器官中G13X的量减少（图5B）。随着时间的延长，小鼠肝和脾中G13X的量逐渐减少（图5C）。上述实验结果表明，G13X可以在不同器官之间易位，最终在肝和脾中富集， 并可能由肝代谢缓慢排出体外。在注射30天后，G13X仍大量富集于肝和脾中，说明G13X能够长期滞留在动物体内（图5C），这种长期滞留与血液中WBC升高具有一致性（见表3）。由于细胞对G13A的吞噬速度远小于G13C和G13N（图2），因此G13A在体内清除较慢。另外，小鼠血液中G13X随时间的增加而逐渐降低，但在30天后血液中仍存有痕量G13X， 这也说明Au NPs能够通过血液循环由其它器官逐渐转移到肝脾中，并被排出体外。这种缓慢的代谢过程增加了G13X的生物毒性风险。
为了进一步考察Au NP是否在体内发生分解，在注射G13C 30天后对小鼠的肝、脾组织进行了TEM表征。如图6所示，在肝组织的上皮细胞和巨噬细胞以及脾组织的淋巴细胞中发现大量的G13C，其粒径没有发生显著减小。此结果表明Au NP在活体体内具有良好的胶体稳定性，能够被上皮�胞和淋巴细胞长期储存，并逐渐被肝脏的巨噬细胞缓慢清除体外。
4结 论
考察了表面电荷对PEG修饰的13 nm Au NPs与细胞相互作用以及在活体体内分布的影响。结果表明， PEG修饰的Au NPs具有较低的生物毒性， Au NPs的表面电荷决定细胞对AuNPs的吞噬量和AuNPs在体内器官的富集量， Au NPs能够通过血液循环在体内发生器官易位，最后富集于肝和脾中并通过肝代谢缓慢排出体外， 细胞对Au NPs的吞噬速度能够影响其在体内的代谢速度， Au NPs在体内能够长时间的保持形貌并能够引起动物的免疫响应。Au NPs在代谢器官中的长期滞留，提示在使用贵金属类纳米药物时必须考虑其对活体细胞及器官功能的长期和潜在的影响。
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