冬虫夏草大米培养基培养条件的正交试验筛选_免费论文全文下载

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摘要 冬虫夏草是一种被人们普遍接受的药用真菌。由于其生长缓慢，培养条件苛刻，故难以大规模人工培养应用。本文以实验室分离得到的虫草菌株Ophiocordyceps sinensis CCTCC M2016041为研究对象，通过正交试验设计对影响虫草菌株在大米培养基上生长的光照、温度和菌液接种量这3个因素进行9 d的观察，每3 d�录菌体的增重量，以确定大米培养基培育虫草的最佳生长条件，并测量其甘露醇含量。结果表明，3个影响因子光照、温度和菌液接种量的重要性在生长初期（前3 d）依次为光照>温度>菌液接种量；在生长中期（3～6 d）为温度>光照>菌液接种量；在生长后期（6～9 d）为光照>温度>菌液接种量。培养虫草菌的最适条件为光照24 h、培养温度25 ℃、1∶1（mL∶g）的菌米接种体积重量比。而米基培养的M2016041菌株菌丝中虫草酸含量为（8.42±0.45） mg/g。本试验能够为人工模拟自然条件下虫草的大规模培养提供一种有效的技术方法。

关键词 冬虫夏草；大米培养基；甘露醇；正交设计
中图分类号 S567.3+5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）10-0063-03
Abstract Ophiocordyceps sinensis is one kind of widely accepted medical fungus.However，it is hard to cultivate artificially for the large scale application because of its slow growth rate and fastidious cultivation conditions.In this study，taking Ophiocordyceps sinensis CCTCC M2016041 reserved in laboratory as test material to study its biological characteristics and the optimal cultivation conditions on rice medium.By means of orthogonal design of experiments on the effects of Ophiocordyceps strain on the rice medium，three factors including light，temperature and inoculum size were observed for 9 days，weight recording every 3 days，in order to tetermine the optimum growth condition.Meanwhile the content of mannitol in the hyphae was determined.It suggested that in the initial growth stage （before 3 days），the range values of three factors were 0.098，0.057 and 0.022，and the ranks of importance was following：light > temperature > inoculum size.In the middle growth stage （3-6 days），the ranks of importance was following：temperature> light > inoculum size.In the late growth stage （6-9 days），the ranks of importance was following：light > temperature > inoculum size.The optimum conditions for culturing cordyceps sinensis were light time 24 h，culture temperature 25 ℃，and volume weight ratio of bacteria and rice as 1∶1.Results were showed that the content of mannose in the hyphae was（8.42±0.45） mg/g.Conclusively，this study could provide an effective technical met-hod which could be artificially simulated under natural conditions for large-scale cultivation of Ophiocordyceps.
Key words Ophiocordyceps sinensis；rice culture medium；mannitol；orthogonal experimental design
目前，世界上已发现冬虫夏草属真菌400多种，其中我国记录有60多种，主要分布在吉林、辽宁、陕西等地[1-2]，而冬虫夏草就是特指以青藏高原为主产地、中国特有的冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）。冬虫夏草属于肉座菌目麦角菌科，是一种能够感染喜马拉雅蝙蝠蛾或虫草蝙蝠蛾幼虫的昆虫病原真菌[2]。研究表明，冬虫夏草在免疫调节、祛痰平喘、对肝肾损伤的保护、抗肿瘤、治疗肝功能衰竭等方面具有明显的效果[2-3]。
近20年来，国内的一些科研院所相继开展了人工培养和深层发酵培养虫草菌丝体的研究，但虫草真菌保健品大部分停留在利用液体培养菌丝体阶段[4-5]，在固体培养基上培养则报道不多。大米培养基是一种常见的虫生真菌固体培养基，在美国和日本得到大量的使用[6-8]。但是现在还没有办法做到冬虫夏草人工栽培的大规模生产，还存在许多技术上的问题，如冬虫夏草菌生长缓慢，侵染率低且侵染的影响因素不明等。不解决这些问题就没有办法实现冬虫夏草的大规模生产[6-7]。另外，由于冬虫夏草是昆虫寄生真菌，表现出高度的宿主特异性，不同地区的虫草菌具有不同的生长特性因素[8]。因此，筛选虫草菌最适的生长条件的培养技术对更好地利用这一宝贵资源至关重要。 本文拟通过浙江省生物计量与检验检疫重点实验室分离得到的虫草菌株M2016041，以常用的大米培养基作为基础培养基对3个影响培育的主要因素（温度、光照和接种比）对虫草菌株的产量和相关指标进行正交试验，筛选出最适虫草生长的条件，以期能够为人工模拟自然条件下虫草的大规模培养提供一种有效的技术方法。
1 材料与方法
1.1 菌种来源及培养准备
从采自宁夏的冬虫夏草虫体上筛选获得一株生长良好的虫草菌株，经18S rRNA鉴定为Ophiocordyceps sinensis，命名为CCTCC M2016041，并已经送至中国典型培养物保藏中心保存。取冰箱中储存的虫草菌株适量接种到SDAY萨氏培养基（Difco）上，放在20 ℃黑暗条件下培养。将培养1周左右的菌落挑取接种到已高温高压灭菌SDB液体培养基（葡萄糖4%、酵母粉1%、蛋白胨1%）中，接种量为固体培养基内总菌种量的50%以上。放入恒温震荡摇床，以150 r/min、20 ℃条件培养7 d。
1.2 大米培养基的制作
称取200 g大米放入烧杯中，加入足量的沸水，搅匀，浸泡30 min后冲洗4～5遍，用纱布彻底滤干后放入60 ℃烘箱中烘15～30 min[9]。取出后用锡箔封好放入高压灭菌锅，121 ℃温度下灭菌15 min。将已灭菌的大米均匀分开后加入上述SDB培养液15 mL，并充分搅拌。再将大米均匀地铺在9 cm培养皿中，每个培养基加10 g灭过菌的大米。
1.3 虫草菌株M2016041的接种方法
取3支干燥洁净的15 mL离心管，依次加入5、10、15 mL上述培养获得的虫草菌液，7 000 r/min离心3 min，去上清，加入10 mL无菌水混匀清洗，7 000 r/min离心5 min后再次去除上清，向沉淀菌体中加入13 mL 0.01% Tween80溶液，用枪头轻轻混匀成悬浊状态待喷雾用。取制作好的上述大米培养基，使喷雾器的喷头与培养基表面呈90°角垂直喷洒，每个培养基喷洒1.5 mL，每种浓度处理9次重复。
1.4 虫草菌株生长最优条件筛选
试验设3个因素，为温度、光照条件、虫草菌的接种量。温度设为20、25、30 ℃ 3个水平，光照条件分别为黑暗24 h、光照24 h、12 h光照12 h黑暗，菌液接种量分别为5、10、15 mL。正交设计方案如表1所示。试验过程中设定接种后的1 d记为作D1，观察分别在D3、D6和D9进行，将大米培养基培养物放入50 mL离心管中再加入25 mL无菌水，进行超声后，8 000 r/min离心5 min后称取菌体的重量。
1.5 甘露醇标准曲线的测定
称取1 g的甘露醇于大��杯中，量取1 L去离子水配制成1 mg/mL的甘露醇溶液，取6支试管分别编号为1～6，向其中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的1 mg/mL的甘露醇溶液，再加入去离子水，使各试管中的甘露醇浓度分别为10、20、30、40、50、0 μg/mL。将配制的溶液分别取1 mL至新的试管，试管对应标记1～6。再向各试管中加入1 mL高碘酸钠溶液，室温放置10 min。10 min后向其中加入2 mL 0.01% L-鼠李酸，最后加入1 mL的Nash试剂，53 ℃水浴15 min。通过对甘露醇标准液的比色法得甘露醇含量的标准曲线。
1.6 虫草甘露醇含量的测定
取培养完全的固体培养基上的虫草菌置于干燥的无菌培养皿中，60 ℃的烘箱中过夜。称取烘干后的虫草菌0.5 g置于50 mL的离心管中超声15 min，离心取上清，重复离心取上清置于5 mL的离心管中，加入一定量的去离子水定容至5 mL即浓度为0.1 g/mL，待用。取6支试管分别编号为1～6，向其中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0 mL的0.1 g/mL的虫草菌液，再加入去离子水，使各试管中的虫草液浓度分别为1、2、3、4、5、0 mg/mL。将配制得到的溶液分别取1 mL至新的试管，试管对应标记1～6。再向各试管中加入1 mL高碘酸钠溶液，室温放置10 min。10 min后向其中加入2 mL 0.01% L-鼠李酸，最后加入1 mL的Nash试剂，53 ℃水浴15 min。通过比色法测得虫草菌样品的OD值，根据标准曲线获得相应的含量值，取其平均数。
2 结果与分析
2.1 最优条件的筛选
虫草菌CCTCC M2016041在大米培养基培养前和固体培养期间的生长状况如图1所示。可以看出，接种后3 d部分大米表面有少许白色斑点产生，但多半大米表面没有改变。菌种的覆盖程度从高到低依次为25 ℃、10 mL菌接种量，30 ℃、15 mL菌接种量，20 ℃、5 mL菌接种量。另一个明显的区别是 25 ℃条件下的米培养基中虫草菌的厚度没有30 ℃的大，但是30 ℃条件下虫草菌的分布较不均匀，覆盖厚的部分较少，其余部分没有长，或者厚度没有20 ℃条件下的虫草菌覆盖厚。接种后6 d，大米表面的米白色斑点部分已经连成片，覆盖面积明显变大，覆盖部分呈现半透明状。虫草菌在20 ℃、15mL菌接种量的大米培养基的生长覆盖厚度比其在25 ℃、5 mL菌接种量和30 ℃、10 mL菌接种量条件下要薄。从接种后9 d虫草培养的状况来看，所有的培养基中的大米表面几乎覆盖完全且厚度较均一。虽然25 ℃下和30 ℃下覆盖厚度没有明显的差别，但20 ℃明显较其他2组的菌要低。
由图2可知，接种后3 d各组菌增长量差异最显著，最能体现单个因素对虫草菌生长的影响。其中处理5增长量最明显，其菌体增重量为0.398 5 g，培养条件为25 ℃、10 mL菌接种量和24 h光照。其次为处理9和处理6，培养条件分别为30 ℃、5 mL菌接种量、12 h光照和30 ℃、10 mL菌接种量、24 h光照。由此可认为，适合虫草菌生长的米培养基的温度条件偏高，为25 ℃或25～30 ℃之间的一个温度，而其光照条件明显偏向光照时间较长的条件。至于菌接种量则没有明显的规律性。接种后6 d，除处理6明显高于其他组外，处理1～5没有明显的区别，还有一个明显的差别在于处理7～9，存在明显的梯度，这3个处理的试验控制的条件是光照时间均为12 h，温度分别为20、25、30 ℃，菌接种量分别为10、15、5 mL。可以推测虫草菌生长到第6天时，温度对其生长有一定的影响，且在给定的温度范围内，菌的增重量随温度的升高而增长。接种后9 d由于所有处理的虫草菌几乎都生长完全，所以各组之间的菌增重量没有明显的差别。 由表2可知，接种后3 d极差分析表明，处理5与其余处理有明显差异，处理5的培养条件为24 h光照、培养温度 25 ℃、10 mL的菌接种量。接种后6 d，菌增重量以处理5、6、9的数据显著性差异最多。接种后9 d虫草菌几乎覆盖大米表面，各处理所得的菌增重量都没有显著性差异。
由上述可得，培养虫草菌的最适条件为光照24 h、培养温度25 ℃、菌接种量10 mL。在生长初期（D3前），3个影响因子光照、温度和菌液接种量的极差值分别为0.098、0.057、0.022，重要性依次为光照>温度>菌液接种量。在生长中期（D3～D6），3个影响因子光照、温度和菌液接种量的极差值分别为0.074、0.101、0.069，重要性依次为温度>光照>菌液接种量。在生长后期（D6～D9），3个影响因子光照、温度和菌液接种量的极差值分别为0.052、0.059、0.040，重要性依次为光照>温度>菌液接种量。在生长初期和中期，各处理间光照和温度因子的差异显著（P

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