禽白血病病毒gp27基因的克隆测序及禽蛋检测_免费论文全文下载

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（延边大学动物医学系）

摘 要：以RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞（CEF）培养物中扩增出gp27片段，将RT-PCR产物重组到质粒栽体pUC19中，并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。对市场销售的鸡蛋进行了gp27抗原检测。结果表明，克隆片段720bp为完整目的基因，与国外分离株同源性达97.4%，市售鸡蛋gp27抗原检出率7%。
关键词：禽白血病病毒；gp27基因；克隆测序
禽白血病（Aian Leukosis）是由反转录病毒科的禽白血病病毒（Aian Leukosis Virus， ALV）和肉瘤病病毒（Avian Sarcoma Virus， ASV）群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。本病在世界各地均有发生，是危害养禽业的主要疾病之一[1]。P27是病毒的主要核心蛋白，分子量为27ku，为主要的群特异性抗原。在禽白血病/肉瘤病毒的检测试验中，均以p27作为抗原制备群特异性抗体，从而建立相应的病毒检测方法。
1 材料与方法
1.1 病毒及质粒
SR-RSV（Schmidt-Ruppin）株，克隆载体质粒pUC19 由本实验室保存。
1.2 试剂
RNA提取试剂盒、M-MLV反转录酶购自美国Gibco BRI公司；UNIQ-5柱离心式DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自大连宝生物工程有限公司。
1.3 引物设计与合成
根据GenBank收录的RSV核苷酸序列，用计算机辅助设计软件Oligo设计了1对引物P1、P2，两引物间的跨幅为720 bp，上游引物（P1：5' -CCCGTGGAATTCATGGCTGTAGTGATTAAG-3'）设计有Eco R I 酶切位点和起始密码子ATG，下游引物（P2：5' -CATACTCGAGGGCTGGATAGCAGACTACAT-3'）设计有Xho I酶切位点和终止密码子。引物由北京六合华大基因有限公司合成。
1.4 核酸提取
将SR-RSV接种于鸡胚成纤维细胞（CEF）上，8 d后收毒，用RNA提取试剂盒（按操作说明书进行）提取核酸。
1.5 RT-PCR扩增gp27基因
RT反应在20？滋L体系中进行。取上述提取核酸2？滋L作为模板，加10 pmol/？滋L引物P11？滋L，90℃10min，立即冰浴5min，加入40U/？滋L核糖核酸酶抑制剂0.5？滋L，dNTP（各2.5mmol/L）2？滋L，5×反转录缓冲液（first strand buffer）4？滋L，200U/？滋L M-Mulv 1？滋L，加DEPC处理的双蒸水至20？滋L，混匀，37℃45min，95℃5min灭活反转录酶。以上述反转录产物为模板的PCR反应在50？滋L体系中进行。反应条件为94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 2min，循环扩增25次，最后72℃延伸10min。扩增产物于含EB的8g/L琼脂糖凝胶中电泳。
1.6 PCR产物的定向克隆
按UNIQ-5柱离心式DNA胶回收试剂盒使用说明回收 Klenow 酶处理的PCR产物和Sma I酶切处理的pUC19质粒，用T4 DNA连接酶连接后转化于感受态宿主菌，用蓝自斑法筛选重组质粒。
1.7 重组质粒的PCR和酶切鉴定
按1.6的反应条件进行PCR反应，反应产物于8g/L琼脂糖凝胶中电泳。用Eco R I、Xho I 进行酶切鉴定。
1.8 重组质粒的序列测定与分析
DNA序列由大连宝生物工程有限公司测定，借助于核苷酸序列分析软件进行分析.并与GenBank中的相关毒株RSV J02342株进行比较。
2 结果
2.1 PCR反应
从接毒雏鸡翅膀肿块和接毒CEF培养物中扩增出的PCR产物，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳得到与预期结果相符的720bp的片段（见图1）。
2.2 重组质粒的PCR鉴定与酶切鉴定
重组质粒的PCR产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，得到与预期结果相符的720 bp的片段。重组质粒经Pvu Ⅱ酶切得到与预期结果相符的片段（见图2）。
2.3 重组质粒的序列测定及分析
对构建的重组质粒进行序列测定及分析，并与已经发表的RSV J02342株核苷酸序列进行比较，同源性达97.7%，表明克隆的片段为gp27基因。
2.4 市售鸡蛋的gp27抗原检测
在本市不同超市随机购买了240枚鸡蛋，利用本实验的方法对鸡蛋蛋清进行了gp27检测。结果表明，市售鸡蛋gp27抗原检出率7%。
3 讨论
禽白血病是世界性分布的历史悠久而又不断出现新型病例的禽类病毒性可传染的肿瘤性疾病，是严重危害养禽业发展的最重要疫病之一。由于病毒亚群个毒株的多样性、相关内源性病毒存在的广泛性，以及传播途径和发病情况的复杂性，使本病很难根除。其危害性不仅是引起病禽（主要是鸡，特别是肉种鸡）的死亡和淘汰，而且引起鸡群生产能力的普遍降低，也影响蛋（胚）源或鸡源细胞的医学研究和生物制品的发展。1997年以来J亚群禽白血病在世界范围内爆发，给养禽业造成了巨大的经济损失。禽白血病病毒的主要蛋白质组分有gag基因编码的核心蛋白，pol基因编码的3种酶，env基因编码的两种糖蛋白。在gag编码的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特异性抗原，他的保守性高，在病毒中的含量高，是制备检测抗体的首选抗原。
RSV核心蛋白gp27基因是其主要的免疫原基因，具有RSV和ALV群特异性，以RSV gp27为抗原建立的免疫琼脂扩散试验及酶联免疫吸附试验等检测方法，其特异性及灵敏性与完整病毒粒子抗原相同。目前适用于大规模流行病学调查和净化的检测方法主要还是针对ALV保守抗原P27的酶联免疫吸附试验（ELISA）。
至今人类对禽白血病的防治还无计可施，既没有疫苗可以利用，也没有有效的药物治疗，控制禽白血病的主要方法是通过病原检测，淘汰阳性鸡，从而净化种群。目前国际金标准的最优净化方案是，对核心鸡群全部采血，接种DF-1细胞进行外源性ALV的分离鉴定，淘汰全部阳性鸡进行种鸡群净化。
参考文献
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[2]殷震，刘景华.动物病毒学[M].第二版.北京：科学出版社，1997.874-884.
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[4]Sandelin K， Estola T. Occurrence of Different Subgroups of Avian Leucosis Virus in Finnish Poultry[J].Avian Pathol，1974，3：159-168.
[5]徐�\蕊，董卫星，余春明.蛋鸡J亚群禽白血病的分子生物学诊断[J].病毒学报，2005，4（21）：289-292.
[6]蔡雪辉，何兆忠，周文举，等.禽白血病/肉瘤病毒群特异性抗原p27的分离和纯化[J]中国畜禽传染病，1995，80（1）：48-51.
[7]萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第三版.金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译.北京：科学出版社，2008.267-269.
通讯作者：宋建臣，副教授。

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