基于16S rRNA基因的食源性致病菌实时荧光定量PCR检测研究_免费论文全文下载

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摘要：本研究以16S rRNA基因作为靶基因，利用TaqMan探针技术建立了针对志贺氏菌（Shigella）、沙门氏菌（Salmonella）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）三种主要食源性致病菌的多重实时荧光定量PCR检测技术。结果表明，建立的荧光定量PCR检测体系特异性良好、灵敏度高、简便快捷，大大缩短了检测时间，在食源性致病菌快速筛查方面具有良好的应用前景。

关键词：食源性致病菌；16S rRNA基因；多重实时荧光定量PCR；TaqMan探针
中图分类号：TS207.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）06-0126-09
AbstractIn this study， a multiplex real-time quantitative PCR detection technology for the three food-borne pathogens， Shigella， Salmonella and Staphylococcus aureus， had been established utilizing the TaqMan probe and 16S rRNA gene as a target gene. The results indicated that the established multiplex real-time quantitative PCR detection system had good specificity and sensitivity， was simple and efficient， and greatly reduced the detection time， so it had a good prospect in the rapid screening for food-borne pathogens.
KeywordsFood-borne pathogen； 16S rRNA gene； Multiplex real-time quantitative PCR； TaqMan probe
食品种类的日益增多在丰富人们消费体验的同时，也带来了更多的食品安全事件。食品安全事件造成的经济损失十分惊人。据相关部门统计，2015年上半年因各类食品安全事件，经济损失至少300亿元，死伤人数近万人[1]。据统计，在全球各类疾病中，食源性疾病的发病率位居前列，因食源性疾病而导致死亡的人数每年约有220万[2]。据世界卫生组织（WHO）报道，影响食品安全最主要的因素之一是由病原微生物引起的食源性疾病。通过对我国食源性疾病监测系统个案报告的资料分析可知，我国发生的食品安全事件中有将近一半是由食源性致病菌所导致的[3，4]，而有效预防和控制食源性疾病的重要环节是快速检测和鉴别食源性致病菌。本研究以食品中常见的三种致病性细菌――志贺氏菌（Shigella）、沙门氏菌（Salmonella）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为对象，研究建立针对这三种致病菌的多重实时荧光定量PCR快速检测技术，这对及时切断病原菌传播途径以达到减少食源性疾病发生的目的具有十分重要的意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株本研究所用菌株共9株，其中福氏志贺氏菌株购自北纳创联生物技术有限公司；金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌及6种对照菌株（大肠杆菌、黄单胞菌、枯草杆菌、产气杆菌、变形杆菌、八叠球菌）均由山东师范大学生命科学学院李世国老师馈赠。将以上菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基试管斜面上，存于4℃冰箱中备用。
1.1.2主要仪器设备台式冷冻离心机（MIKRO 22R），德国Hettich公司；BioPhotometer Plus仪，德国Eppendorf公司；PCR八联管，美国应用生物系统公司；Step One Plus实时荧光定量PCR系统，美国应用生物系统公司；微量移液器（0.5～10 μL，10～100 μL），德国Eppendorf公司。
1.2试验方法
1.2.1细菌基因组DNA的提取分别采用三种不同的细菌DNA提取方法，即普通的CTAB法、CWBIO Bacteria Genomic DNA Kit和TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒，并对其提取结果进行比较，选取效果最好的提取方法。最终选用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒法。
1.2.2引物与探针的设计根据GenBank中三种细菌16S rRNA基因序列，用DNAMAN V6中文版进行同源性比对分析，选择其高度保守的区域，根据引物设计的原则，运用软件Primer Premier 5.0设计一对兼并引物[5]。
利用DNAMAN V6软件对Shigella、Salmonella和Staphylococcus aureus进行同源性序列的分析比对，选取三种菌双链DNA序列中最特异的区段作为靶序列，用Primer Express V 3.0软件设计各菌的TaqMan探针。交由生工生物工程技术服务公司（上海）合成。选择各条探针的荧光标记，5′端报告基团可以为FAM、VIC、NED等，3′端的�晒獯忝鸹�团用MGB、BHQ1等。引物和探针见表1。
1.2.3多重荧光定量PCR反应体系的建立采用50 μL反应体系，将单重荧光定量PCR各组分浓度（表2）加倍，将3株菌的探针和模板DNA放入同一个PCR反应管中，成为三重荧光定量PCR反应体系（表3）。扩增程序为95℃预变性30 s；95℃变性1 s，60℃退火20 s，40个循环。
1.3荧光定量PCR反应体系性能评价
1.3.1特异性本试验利用建立的多重荧光定量PCR反应体系对供试3株细菌及另外6株细菌（大肠杆菌、黄单胞菌、枯草杆菌、八叠球菌、产气杆菌、变形杆菌）进行荧光定量PCR试验，对该PCR体系的特异性进行评价。 1.3.2灵敏度用BioPhotometer Plus仪测定提取的细菌基因组DNA原液浓度，然后稀释到100 ng/μL，在此基础上按10倍梯度稀释，DNA浓度从10 ng/μL到10-5 ng/μL共设7个梯度。按照建立的荧光定量PCR体系进行试验，确定该体系能够检测到的最低DNA浓度，评价体系的灵敏度。
1.4模拟样品试验
1.4.1模拟水样和牛奶样本的制备分别挑取3种供试菌单菌落接种到LB琼脂平板，37℃过夜培养，取菌苔至5 mL无菌PBS中制备菌悬液，用无菌PBS 10倍系列稀释菌悬液至10-8。取10-5、10-6、10-7、10-8四个梯度各100 μL涂LB琼脂平板，重复3次，37℃过夜培养，利用平板计数法推算原菌悬液的准确浓度。对经菌落计数的菌悬液用无菌PBS 10倍系列稀释，取浓度为n×107、n×106、n×105、n×104、n×103、n×102、n×101 cfu/mL（1≤n

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